在細(xì)胞生物學(xué)研究中，
24孔板0.4µm細(xì)胞培養(yǎng)小室無(wú)菌是構(gòu)建細(xì)胞共培養(yǎng)體系、研究細(xì)胞遷移與侵襲能力的經(jīng)典工具。該孔徑既能有效分隔上下室細(xì)胞，允許信號(hào)分子自由流通，又能阻止細(xì)胞隨意穿越，是模擬體內(nèi)生理屏障的理想模型。然而，這一精密實(shí)驗(yàn)的成功與否，高度依賴于嚴(yán)格的無(wú)菌操作流程。本文將系統(tǒng)闡述從實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備到細(xì)胞接種的全過(guò)程無(wú)菌操作規(guī)范，旨在為科研工作者提供一套標(biāo)準(zhǔn)化、可復(fù)制的操作指南。
一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備與環(huán)境滅菌：構(gòu)筑無(wú)菌防線
在進(jìn)行任何細(xì)胞操作之前，構(gòu)建一個(gè)潔凈的無(wú)菌環(huán)境是首要前提。這不僅關(guān)乎實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，更直接決定了細(xì)胞能否存活。
1.超凈工作臺(tái)預(yù)處理：實(shí)驗(yàn)開始前，需提前打開超凈工作臺(tái)的紫外燈，照射臺(tái)面及內(nèi)部物品30分鐘以上，以殺滅空氣中的微生物。照射結(jié)束后，關(guān)閉紫外燈，開啟風(fēng)機(jī)運(yùn)行10-15分鐘，排出殘留的臭氧。操作前，需用75%酒精棉球擦拭臺(tái)面及雙手。
2.耗材與試劑消毒：將預(yù)熱的培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胰蛋白酶等試劑瓶外表面用75%酒精擦拭后放入超凈臺(tái)。所有接觸細(xì)胞的耗材，如移液器吸頭、離心管等，必須確保無(wú)菌。操作過(guò)程中應(yīng)始終在酒精燈火焰旁的無(wú)菌區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，打開的瓶口需短暫過(guò)火滅菌。
二、小室預(yù)處理與膜潤(rùn)濕：打通物質(zhì)交換通道
0.4µm的微孔膜是實(shí)驗(yàn)的核心，其預(yù)處理直接關(guān)系到后續(xù)細(xì)胞能否正常貼壁生長(zhǎng)及信號(hào)分子的通透性。
1.膜潤(rùn)濕操作：將Transwell小室小心放入24孔板的對(duì)應(yīng)孔位中。使用無(wú)菌移液器，向上室（小室內(nèi)）緩慢加入100-200µL的無(wú)血清培養(yǎng)基或PBS緩沖液。加入液體時(shí)，槍頭應(yīng)盡量貼近小室壁，避免液體直接沖擊膜面產(chǎn)生氣泡。這一步驟的目的是利用液體浸潤(rùn)膜孔，排出膜內(nèi)的空氣，確保膜全部水化。若膜上殘留氣泡，會(huì)阻礙營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)，導(dǎo)致局部細(xì)胞死亡。
2.氣泡排除技巧：加入液體后，仔細(xì)觀察膜表面。若發(fā)現(xiàn)氣泡附著，可輕輕傾斜小室，或用槍頭在膜邊緣輕輕引導(dǎo)，使氣泡匯集后排出。確認(rèn)膜面濕潤(rùn)均勻且無(wú)氣泡后，將小室置于37℃培養(yǎng)箱中平衡至少30分鐘，或直接進(jìn)行下一步操作。
三、細(xì)胞懸液制備與無(wú)菌接種：精準(zhǔn)投放生命種子
細(xì)胞接種是無(wú)菌操作中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，任何疏忽都可能導(dǎo)致微生物污染，前功盡棄。
1.細(xì)胞消化與重懸：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS清洗后加入適量胰蛋白酶進(jìn)行消化。待細(xì)胞變圓脫落時(shí)，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清。
2.細(xì)胞計(jì)數(shù)與稀釋：用適量的無(wú)血清培養(yǎng)基（用于遷移實(shí)驗(yàn)）或培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板或自動(dòng)計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整細(xì)胞密度至適宜濃度（通常為1×10^5至5×10^5 cells/mL）。
3.無(wú)菌接種：用無(wú)菌移液器吸取適量細(xì)胞懸液（通常為100-200µL），緩慢加入Transwell小室的上室中。加入時(shí)動(dòng)作要輕柔，避免產(chǎn)生氣泡或液體濺出。接種完成后，可輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使細(xì)胞均勻分布在膜上。
4.下室培養(yǎng)基添加：向24孔板的下室（即小室下方的孔內(nèi)）加入500-600µL的培養(yǎng)基（或含特定趨化因子的培養(yǎng)基）。添加時(shí)需注意，下室液面高度應(yīng)略低于小室內(nèi)的液面，或與之持平，切勿過(guò)高導(dǎo)致液體滲入上室，破壞濃度梯度。
四、培養(yǎng)觀察與終點(diǎn)處理：守護(hù)數(shù)據(jù)完整性
細(xì)胞接種完成后，需將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，應(yīng)盡量避免頻繁取出觀察，以減少溫度波動(dòng)和污染風(fēng)險(xiǎn)。通常培養(yǎng)12-48小時(shí)后，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行固定、染色和細(xì)胞計(jì)數(shù)。
總結(jié)
24孔板0.4µm細(xì)胞培養(yǎng)小室無(wú)菌操作流程，本質(zhì)上是一場(chǎng)與微生物污染的博弈。從環(huán)境滅菌到膜潤(rùn)濕，再到細(xì)胞接種，每一個(gè)步驟都要求操作者具備高度的無(wú)菌意識(shí)和嫻熟的技巧。只有嚴(yán)格遵守上述流程，才能確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)可靠，為生命科學(xué)研究提供堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)支撐。
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更新時(shí)間：2026-02-10 
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